本发明公开了一种巢式PCR扩增引物,包括第一次PCR扩增引物(fM1、rC5)和第二次PCR扩增引物(GC夹-f515、rC5)。本发明还同时公开了利用上述引物进行的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR快速检测方法,包括如下步骤:1)、铁皮石斛总基因组DNA的提取;2)、特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段:第一次PCR扩增时,退火温度为50-54°C;第二次PCR扩增时,退火温度为55-59°C;3)、DGGE分析:将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳;4)、内生细菌的种属鉴定:选择清晰的DGGE条带,进行PCR扩增;将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定种属特征。
1.巢式PCR扩增引物,其特征是:包括第一次PCR扩增引物和第二次PCR扩增引物,所述第一次PCR扩增引物为:fM1:5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’,rC5:xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’;所述第二次PCR扩增引物为:GC夹-f515:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGTxa0GCCAGCMGCCGCGGTAA-3’;rC5:xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。
2.利用权利要求1所述巢式PCR扩增引物进行的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR快速检测方法,其特征是包括如下步骤:1)、铁皮石斛总基因组DNA的提取;2)、特异性巢氏PCR扩增16Sxa0rRNA基因的特定片段:第一次PCR扩增时,退火温度为50-54°C;第二次PCR扩增时,退火温度为55-59°C;3)、DGGE分析;将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳;xa04)、内生细菌的种属鉴定:选择清晰的DGGE条带,进行PCR扩增;将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定其种属特征。
3.根据权利要求2所述的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法,其特征在于:所述步骤3)为:DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶、30%-60%的变性剂浓度梯度;打开电泳仪使电泳缓冲液预热60-120min至温度为55-65°C;加40-60μ1xa0PCR产物,120-180V电泳5-10h后,将DGGE胶在EB溶液中染色10-20xa0min,脱色15-30min,用凝胶成像系统拍照。
4.根据权利要求3所述的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法,其特征在于:所述步骤4)为:选择清晰的DGGE条带,割胶回收于1.5mlxa0Eppendorf管中,用无菌研磨棒研磨,加入50xa0μ1无菌水,37°C温浴15-30xa0min,置4°C冰箱12-16h;1500~2500xa0rpm离心4~6min,吸取3-5xa0μ1上清作为模板,用引物f515和rC5进行PCR扩增,退火温度为54-58°C;将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定其种属特征;引物f515:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’,引物rC5:5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。技术领域
本发明涉及一种铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法。
背景技术
作为地球上最古老的生物,在38亿年的进化历史长河中,微生物与植物形成了超级共生体,双方通过基因与信息交流,微生物与植物的进化、生长繁殖、免疫、抗逆及次生代谢等产生了千丝万缕的联系。作为植物的“第二基因组”,微生物通过固氮、分泌激素、分解有机物及促进水分和矿质元素的吸收等多种途径促进植物的生长。内生菌还能分泌抗生素类物质,或直接产生活性成分而促进药用植物的品质形成。因此,微生物生态与药用植物的产量和品质密切相关,微生物生态被认为是药材道地性的重要成因之一。因此,微生物生态检测是衡量中药材的生长状况和品质控制的重要指标。目前,微生物生态研究可采用传统分离培养及分子生物学方法。传统分离培养法由于只能培养1%左右的微生物,因此在微生物生态研究中往往作为一种辅助方法;基于16Sxa0rRNA基因的分子生物学是微生物生态研究的主要手段。根据“内共生假说”,植物中的叶绿体及线粒体均由细菌进化而来,叶绿体及线粒体的16S/18Sxa0rRNA与细菌16Sxa0rRNA具有较高的同源性,因此研究植物内生菌必须设计特异性引物以区分叶绿体16Sxa0rRNA和线粒体18Sxa0rRNA基因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法及所用引物,本发明解决了现有通用引物无法区分细菌的16Sxa0rRNA与植物叶绿体16Sxa0rRNA和线粒体18Sxa0rRNA这一难题。为了解决上述技术问题,本发明提供一种巢式PCR扩增引物,包括第一次PCR扩增引物和第二次PCR扩增引物,第一次PCR扩增引物为:fM1:5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’,rC5:xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’;第二次PCR扩增引物为:GC夹-f515:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGTxa0GCCAGCMGCCGCGGTAA-3’;rC5:xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。本发明还同时提供了利用上述巢式PCR扩增引物进行的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR快速检测方法,包括如下步骤:1)、铁皮石斛总基因组DNA的提取;2)、特异性巢氏PCR扩增16Sxa0rRNA基因的特定片段:第一次PCR扩增时,退火温度为50-54°C;第二次PCR扩增时,退火温度为55-59°C;3)、DGGE分析;将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳;xa04)、内生细菌的种属鉴定:选择清晰的DGGE条带,进行PCR扩增;将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定其种属特征。作为本发明的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法的改进:步骤3)为:DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶(60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得)、30%-60%的变性剂浓度梯度;打开电泳仪使电泳缓冲液(1×TAE电泳缓冲液)预热60-120min至温度为55-65°C;加40-60μ1xa0PCR产物(即,步骤2)第二次PCR扩增所得),120-180V电泳5-10h后,将DGGE胶在EB溶液(浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液)中染色10-20xa0min,脱色15-30min,用凝胶成像系统拍照。作为本发明的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法的进一步改进:步骤4)为:选择清晰的DGGE条带,割胶回收于1.5mlxa0Eppendorf管中,用无菌研磨棒研磨,加入50xa0μ1无菌水,37°C温浴15-30xa0min,置4°C冰箱12-16h;1500~2500xa0rpm离心4~6min,吸取3-5xa0μ1上清作为模板,用引物f515和rC5进行PCR扩增,退火温度为54-58°C;将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定其种属特征;引物f515:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’,引物rC5:5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。备注说明:本发明所涉及的引物中:N=(A/G/C/T),R=(A/G),B=(G/C/T),Y=(C/T),H=(A/C/T);M=(A/C)。步骤4)中的扩增体系为:l0×Bufferxa05μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa01μ1,2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(f515)、2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板,5xa0U·μ1^-1xa0Taqxa0酶0.4xa0μ1,去离子水38.6xa0μ1。本发明的步骤1)铁皮石斛总基因组DNA的提取方法采用改良CTAB法。具体为:以铁皮石斛的根或茎作为样品,将样品表面消毒后,液氮研磨至粉末状,装入1.5xa0mlxa0无菌的eppendorf管中,每管装0.2xa0g;加入1mlxa0CTAB提取液(CTAB提取液由以下成分组成:100xa0mMxa0pH8.0xa0Tris-HCl;20xa0mMxa0pH8.0xa0EDTA;1.4Mxa0NaCl;20mgxa0CTAB--十六烷基三甲基溴化铵;其余为水),于64~66°C水浴60-90min;离心取上清,加入苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1,共计用量为上清体积的2/3),充分混匀,离心取上清,加入氯仿/异戊醇(体积比为24:1,共计用量为上清体积的2/3)充分混匀,离心取上清,加入1/10xa0上清体积的NaAC溶液(浓度为2M~4M)和1个上清体积的无水乙醇,沉淀;离心弃上清,70%乙醇(体积浓度)洗涤所得沉淀,离心弃上清,真空干燥;加入50-100xa0μ1xa0TE溶液(pH=8.0)溶解DNA。本发明的步骤2)中:第一次PCR扩增时:扩增体系为:l0×Bufferxa02.5xa0μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa00.5xa0μ1,1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(fM1),1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板(步骤1)所得),5xa0U·xa0μ1^-1xa0Taq酶0.2xa0μ1xa0,去离子水18.8xa0μ1。第二次PCR扩增时:扩增体系为:l0×Bufferxa05xa0μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa01xa0μ1,2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(GC夹-f515),2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板(第一次PCR扩增所得),5xa0U·μ1^-1xa0Taq酶0.4μ1,去离子水38.6μ1。本发明与现有技术相比,检测结果重复性好、操作简便,为铁皮石斛内生细菌的检测、鉴定及分析优势种群提供了有效方法。综上所述,本发明基于细菌的16Sxa0rRNA与铁皮石斛叶绿体16Sxa0rRNA和线粒体18Sxa0rRNA基因序列,设计特异性引物,建立铁皮石斛内生细菌的巢式PCR检测方法,以期对铁皮石斛内生细菌的多态性及优势种群进行分析,从而为监控铁皮石斛的生长状况和品质提供依据。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为萧山铁皮石斛根部和茎部的DGGE电泳图谱。图2为奉化铁皮石斛根部和茎部的DGGE电泳图谱。图3为庆元铁皮石斛根部和茎部的DGGE电泳图谱。图4萧山铁皮石斛样品在不同DGGE电泳条件下的图谱。
具体实施方式
实施例1萧山人工栽培的铁皮石斛植株,采用以下步骤分析该样品根(XSG)和茎(XSJ)中的内生细菌种群结构:即分别以铁皮石斛的根(XSG)和茎(XSJ)作为样品:1)铁皮石斛总基因组DNA的提取:采用改良CTAB法,对根部和茎部进行表面消毒;样品先用流水充分冲洗,从而去掉表面土壤颗粒等杂质,然后转移至超净台内用无菌水清洗2次,每次1xa0min;接着用75%(V/V)酒精消毒20xa0sec、3%(质量%)次氯酸钠溶液消毒4xa0min,无菌水洗涤3次,用灭过菌的滤纸将表面水分吸干。液氮研磨直至粉末状;装入1.5xa0mlxa0无菌的eppendorf管中,每管装0.2xa0g;加入1mlxa0CTAB提取液(CTAB提取液由以下成分组成:100xa0mMxa0pH8.0xa0Tris-HCl;20xa0mMxa0pH8.0xa0EDTA;1.4Mxa0NaCl;20mgxa0CTAB--十六烷基三甲基溴化铵;其余为水),于65°C水浴90min;离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1,总用量为上清体积的2/3);离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入氯仿/异戊醇(体积比为24:1,总用量为上清体积的2/3);离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入1/10xa0上清体积的3Mxa0NaAC溶液和1个上清体积的无水乙醇,-20°C沉淀30xa0min;离心(8000xa0rpm,5xa0min)弃上清,用0.5mlxa070%(体积浓度)的酒精洗涤所得沉淀两次;离心(8000xa0rpm,5min)弃上清,真空干燥(50mb的真空度和25°C的温度干燥至恒重);加入50xa0μ1xa0TE缓冲溶液(pH=8.0)溶解DNA。2)特异性巢氏PCR扩增16Sxa0rRNA基因的特定片段:a.特异性巢式PCR以fM1(5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’)和rC5(xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’)为第一次PCR扩增引物,PCR扩增的退火温度为54°C。扩增体系为:l0×Bufferxa02.5xa0μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa00.5xa0μ1,1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(fM1)、1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5)、1xa0μ1xa0DNA模板(步骤1)所得),5xa0U·xa0μ1^-1xa0Taq酶0.2xa0μ1xa0,去离子水18.8xa0μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,54°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。b.采用引物GC夹-f515(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGxa0GGGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和rC5作为巢式PCR第二次扩增引物,退火温度为57°C。扩增体系为:l0×Bufferxa05xa0μ1,10mmol·xa0μ1^-1xa0dNTPxa01xa0μ1,2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(f515-GC夹),2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板(上述步骤a所得),5xa0U·μ1^-1xa0Taq酶0.4μ1,去离子水38.6μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,57°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。3)DGGE分析:将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳。DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶(60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得,该凝胶的用量共计为40ml)、30%-60%的(30%是指在6%丙烯酰胺凝胶中加入变性剂直至变性剂的质量浓度为30%,60%是指在6%丙烯酰胺凝胶中加入变性剂直至变性剂的质量浓度为60%)变性剂浓度梯度;打开电泳仪使xa01×TAE电泳缓冲液(即Tris-乙酸电泳缓冲液(1×TAE))预热120min至温度为60°C;加60μ1xa0PCR产物,160V电泳7h,DGGE胶在EB溶液(浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液)中染色15min,脱色30min(即进行胶体背景颜色的处理),凝胶成像系统拍照。备注说明:30%-60%的变性剂浓度梯度通过专用的配置DGGE胶的变性胶梯度仪进行配胶,此为常规技术。变性剂由尿素和去离子甲酰胺按照以下比例配制而成:尿素(g)/去离子甲酰胺(ml)=12.6g:12ml。4)内生细菌的种属鉴定:选择清晰的DGGE条带,割胶回收于1.5mlxa0eppendorfxa0管中,用无菌研磨棒充分研磨,加入50xa0μ1xa0无菌水,37°C温浴15min,置于4°C冰箱14h;2000xa0rpm离心5min,吸取5xa0μ1上清作为模板,用引物f515(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和rC5(xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’)进行PCR扩增,退火温度为56°C。扩增体系为:l0×Bufferxa05μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa01μ1,2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(f515)、2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板,5xa0U·μ1^-1xa0Taqxa0酶0.4xa0μ1,去离子水38.6xa0μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,56°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定其种属特征。备注说明:上述克隆、测序和BLAST比对可分别依据已经公开发表的AT克隆法、sanger终止法测序、NCBI网站上进行BLAST比对。图1中的清晰条带标记为XS1、XS2、XS3、XS4、XSJ1、XSJ2、XSJ3、XSJ4、XSJ5。(备注说明:XS对应的是铁皮石斛的根,XSJ对应的是铁皮石斛的茎);结果:XS1近缘株为Unculturedxa0Xanthomonadaceaexa0bacteriu,登录号为FR668350.1;xa0XS2近缘株为Rhodanobacterxa0sp.xa0B64,登录号为EU194895.1;XS3近缘株为Burkholderiaxa0sp.xa0SR-SRT03,登录号为JX885702.1;XS4近缘株为Burkholderiaxa0sp.xa0G12,登录号为JN975201.1;XSJ1近缘株为Clostridiumxa0sp.xa0enrichmentxa0culturexa0clonexa0AP-FeEnrich8,登录号为JX828416.1;XSJ2近缘株为Unculturedxa0bacteriumxa0isolatexa0DGGExa0gelxa0bandxa0B9,登录号为EU680806.1;XSJ3近缘株为Burkholderiaxa0glatheixa0,登录号为AM392330.1;XSJ4近缘株为Burkholderiaxa0sp.xa0ZBC2,登录号为JQ638272.1;XSJ5近缘株为Unculturedxa0Burkholderiaxa0sp.xa0clonexa0YYSM138,登录号为EU628909.1xa0。xa0最终可确定:萧山铁皮石斛根部内生细菌分别属于黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)和伯克氏菌属(Burkholderia);萧山铁皮石斛茎部内生细菌分别属于梭菌属(Clostridium)、伯克氏菌属(Burkholderia)和未鉴定菌株。实施例1设置了5个重复,结果均一致。验证实验1:将实施例1所述的萧山基地人工栽培的铁皮石斛植株,按照目前现有的高通量测序法对其根和茎进行检测;所得结果为:结果与实施例1相同。对比实验1:将实施例1步骤3)中的电泳时间7h改成5h;其余等同于实施例1。最终所得的结论为(如图4所示):DGGE条带不清晰,并且条带明显较少;导致最终结论的准确性较差。实施例2奉化人工栽培的铁皮石斛植株,采用以下步骤分析该样品根(FHG)和茎(FHJ)中的内生细菌种群结构:即分别以铁皮石斛的根(FHG)和茎(FHJ)作为样品:1)铁皮石斛总基因组DNA的提取:采用改良CTAB法,对根部和茎部进行表面消毒;样品先用流水充分冲洗,从而去掉表面土壤颗粒等杂质,然后转移至超净台内用无菌水清洗2次,每次1xa0min;接着用70%(V/V)酒精消毒20xa0sec、3%(质量%)次氯酸钠溶液消毒4xa0min,无菌水洗涤3次,用灭过菌的滤纸将表面水分吸干。液氮研磨直至粉末状;装入1.5xa0mlxa0无菌的eppendorf管中,每管装0.2xa0g;加入1mlxa0CTAB提取液于65°C水浴60xa0min;离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1,总用量为上清体积的2/3);离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入氯仿/异戊醇(体积比为24:1,总用量为上清体积的2/3);离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入1/10xa0上清体积的3Mxa0NaAC溶液和1个上清体积的无水乙醇,-20°C沉淀30xa0min;离心(8000xa0rpm,5xa0min)弃上清,用0.5mlxa070%(体积浓度)的酒精洗涤所得沉淀两次;离心(8000xa0rpm,5min)弃上清,真空干燥(50mb的真空度和25°C的温度干燥至恒重);加入50xa0μ1xa0TE缓冲溶液(pH=8.0)溶解DNA。xa02)特异性巢氏PCR扩增16Sxa0rRNA基因的特定片段:a.特异性巢式PCR以fM1(5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’)和rC5(xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’)为第一次PCR扩增引物,PCR扩增的退火温度为54°C。扩增体系为:l0×Bufferxa02.5xa0μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa00.5xa0μ1,1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(fM1),1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板(步骤1)所得),5xa0U·xa0μ1^-1xa0Taq酶0.2xa0μ1xa0,去离子水18.8xa0μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,54°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。xa0xa0xa0b.采用引物GC夹-f515(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGxa0GGGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和rC5作为巢式PCR第二次扩增引物,退火温度为57°C。扩增体系为:l0×Bufferxa05xa0μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa01xa0μ1,2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(f515-GC夹),2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板(步骤a所得),5xa0U·μ1^-1xa0Taq酶0.4μ1,去离子水38.6μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,57°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。3)DGGE分析:将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳。DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶(60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得,该凝胶的用量共计为40ml)、30%-60%的变性剂浓度梯度;打开电泳仪使xa01×TAE电泳缓冲液预热120min至温度为60°C;加60μ1xa0PCR产物,120V电泳10h,DGGE胶在EB溶液(质量浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液)中染色15min,脱色20min(即进行胶体背景颜色的处理),凝胶成像系统拍照。4)内生细菌的种属鉴定:选择清晰的DGGE条带,割胶回收于1.5mlxa0eppendorfxa0管中,用无菌研磨棒充分研磨,加入50xa0μ1xa0无菌水,37°C温浴15min,置于4°C冰箱16h;2000xa0rpm离心5min,吸取5xa0μ1上清作为模板,用引物f515(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和rC5(xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’)进行PCR扩增,退火温度为56°C。扩增体系为:l0×Bufferxa05μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa01μ1,2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(f515),2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板,5xa0U·μ1^-1xa0Taqxa0酶0.4xa0μ1,去离子水38.6xa0μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,56°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定其种属特征。备注说明:上述克隆、测序和BLAST比对可分别依据已经公开发表的AT克隆法、sanger终止法测序、NCBI网站上进行BLAST比对。图2中的清晰条带标记为FH1、FH2、FH3、FH4、FHJ1、FHJ2、FHJ3、FHJ4、FHJ5。结果:FH1近缘株为Unculturedxa0Bordetellaxa0sp.xa0clonexa034,登录号为EU723426.1;FH2近缘株为Unculturedxa0bacteriumxa0clonexa0nbw502a12c1,登录号为GQ101982.1;FH3近缘株为Gammaxa0proteobacteriumxa0SCGCxa0AAA044-D14,登录号为HQ663449.1;FH4近缘株clonexa0TA_95,登录号为JQ048310.1;FHJ1近源株为Unculturedxa0Moraxellaceaexa0bacteriumxa0clonexa0TA_95(近源株登录号为JQ048310.1),FHJ1在NCBI上的登录号为KC465205;FHJ2近缘株为Pseudomonasxa0sp.xa0PK-3,登录号为EU685822.1;FHJ3近缘株为Burkholderiaxa0tropicaxa0strainxa0E276b,登录号为JN695890.1;FHJ4近缘株为Unculturedxa0bacterium,登录号为HF544749.1;FHJ5近缘株为Unculturedxa0organismxa0clone,登录号为HQ755085.1。最终可确定:奉化铁皮石斛根部内生细菌分别属于鲍特杆菌属(Bordetella)、沙雷氏菌属(Serratia)和未鉴定菌株;奉化铁皮石斛茎部内生细菌分别属于假单胞菌目(Pseudomonadales)和伯克氏菌属(Burkholderia)。实施例2设置了5个重复,结果均一致。验证实验2:将实施例2所述的奉化人工栽培的铁皮石斛植株,按照目前现有的高通量测序法对其根和茎进行检测;所得结果为:结果与实施例2相同。实施例3庆元人工栽培的铁皮石斛植株,采用以下步骤分析该样品根(QYG)和茎(QYJ)中的内生细菌种群结构:即分别以铁皮石斛的根(QYG)和茎(QYJ)作为样品:1)铁皮石斛总基因组DNA的提取:采用改良CTAB法,对根部和茎部进行表面消毒;样品先用流水充分冲洗,去掉表面土壤颗粒等杂质后,转移至超净台内用无菌水清洗2次,每次1xa0min;接着用75%(V/V)酒精消毒20xa0sec、3%(质量%)次氯酸钠溶液消毒4xa0min,无菌水洗涤3次,用灭过菌的滤纸将表面水分吸干。液氮研磨直至粉末状;装入1.5xa0mlxa0无菌的eppendorf管中,每管装0.2xa0g;加入1mlxa0CTAB提取液于65°C水浴70min;离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1,总用量为上清体积的2/3);离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入氯仿/异戊醇(体积比为24:1,总用量为上清体积的2/3);离心(12000xa0rpm,10xa0min)取上清,加入1/10xa0上清体积的3Mxa0NaAC溶液和1个上清体积的无水乙醇,-20°C沉淀45xa0min;离心(8000xa0rpm,5xa0min)弃上清,用0.5mlxa070%(体积浓度)的酒精洗涤所得沉淀两次;离心(8000xa0rpm,5min)弃上清,真空干燥(50mb的真空度和25°C的温度干燥至恒重);加入50xa0μ1xa0TE缓冲溶液(pH=8.0)溶解DNA。2)特异性巢氏PCR扩增16Sxa0rRNA基因的特定片段:a.特异性巢式PCR以fM1(5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’)和rC5(xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’)为第一次PCR扩增引物,PCR扩增的退火温度为54°C。扩增体系为:l0×Bufferxa02.5xa0μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa00.5xa0μ1,1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(fM1),1xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板,5xa0U·xa0μ1^-1xa0Taq酶0.2xa0μ1xa0,去离子水18.8xa0μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,54°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。xa0b.采用引物GC夹-f515(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGxa0GGGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和rC5作为巢式PCR第二次扩增引物,退火温度为57°C。扩增体系为:l0×Bufferxa05xa0μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa01xa0μ1,2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(f515-GC夹),2xa0μ1xa010xa0pmol·μ1^-1引物(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板,5xa0U·μ1^-1xa0Taq酶0.4μ1,去离子水38.6μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,57°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。3)DGGE分析:将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳。DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶(60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得,该凝胶的用量共计为40ml)、30%-60%的变性剂浓度梯度;打开电泳仪使xa01×TAE电泳缓冲液预热120min至温度为60°C;加60μ1xa0PCR产物,160V电泳7h,DGGE胶在EB溶液(质量浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液)中染色15min,脱色30min(即进行胶体背景颜色的处理),凝胶成像系统拍照。4)内生细菌的种属鉴定:选择清晰的DGGE条带,割胶回收于1.5mlxa0eppendorfxa0管中,用无菌研磨棒充分研磨,加入50xa0μ1xa0无菌水,37°C温浴15min,置于4°C冰箱14h;2000xa0rpm离心5min,吸取5xa0μ1上清作为模板,用引物f515(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和rC5(xa05’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’)进行PCR扩增,退火温度为56°C。扩增体系为:l0×Bufferxa05μ1,10mmol·μ1^-1xa0dNTPxa01μ1,2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(f515),2μ1xa010xa0pmol·μ1^-1(rC5),1xa0μ1xa0DNA模板,5xa0U·μ1^-1xa0Taqxa0酶0.4xa0μ1,去离子水38.6xa0μ1;扩增程序为:94°C预热4xa0min;94°C变性1xa0min,56°C复性1xa0min,72°C延伸45s,循环30次;72°C延伸8xa0min,8°C保存。将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对,确定其种属特征。备注说明:上述克隆、测序和BLAST比对可分别依据已经公开发表的AT克隆法、sanger终止法测序、NCBI网站上进行BLAST比对。图3中的清晰条带标记为QY1、QY2、QY3、QY4、QY5、QYJ1、QYJ2、QYJ3、QYJ4、QYJ5、QYJ6、xa0QYJ7。结果:QY1近缘株为Sphingomonasxa0sp.xa0N67,登录号为HM241216.1;QY2近缘株为Pseudomonasxa0sp.xa0enrichmentxa0culturexa0clonexa0C2(2012),登录号为JX965944.1;QY3近缘株为Unculturedxa0bacteriumxa0clonexa0TNOr1w05Fastd2_18863,登录号为JQ372059.2;QY4近缘株为Burkholderiaxa0sp.xa0S43,登录号为JX293318.1;QY5近缘株为Unculturedxa0Burkholderiaxa0sp.xa0clonexa0Bi4E12,登录号为JQ994113.1;QYJ1近缘株为Unculturedxa0bacterium,登录号为HF544749.1;QYJ2近缘株为Unculturedxa0gammaxa0proteobacteriumxa0clonexa0AAA174_E22,登录号为JN839756.1;QYJ3近缘株为Novosphingobiumxa0rosa,登录号为AB680810.1;QYJ4近缘株为Pseudomonasxa0sp.xa0B22(2012b),登录号为JN975132.1;QYJ5近缘株为Novosphingobiumxa0sp.xa0Lig18,登录号为JQ917960.1;QYJ6近缘株为Burkholderiaxa0sp.xa0G1-11,登录号为KC153262.1;QYJ7近缘株为Sphingomonasxa0sp.,登录号为AB076396.1。最终可确定:庆元铁皮石斛根部内生细菌分别属于鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、伯克氏菌属(Burkholderia)和未鉴定菌株;庆元铁皮石斛茎部内生细菌分别属于假单胞菌目(Pseudomonadales)、伯克氏菌属(Burkholderia)、新鞘脂菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和未鉴定菌株。实施例3设置了5个重复,结果均一致。验证实验3:将实施例3所述的庆元人工栽培的铁皮石斛植株,按照目前现有的高通量测序法对其根和茎进行检测;所得结果为:结果与实施例3相同。最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="418"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>